美洲雕鸮是一夫一妻制，形成了配对后，会伴随幼鸟直至成年。
雄鸟和雌鸟在筑巢时交替休息和狩猎。大部分狩猎活动都由雄鸟进行，而雌鸟则花费很多时间来保护雏鸟。
美洲雕鸮通常是在夜间猎食，活动通常在黄昏开始。
美洲雕鸮的威力足以捕获比自身体重2-3倍的猎物。主要狩猎体型小至中等的哺乳动物，捕获的猎物种类繁多，但兔子和野兔是其首选猎物。
美洲雕鸮没有嗅觉，因此对于地球上最臭的动物——臭鼬来说，美洲雕鸮是它们为数不多的天敌之一。
美洲雕鸮利用它们的视线来寻找猎物并在黑暗中航行，甚至穿越茂密的森林。它们具有双眼视力，可以提供出色的正面视力，但视野较弱。
美洲雕鸮的卵及雏鸟是狐狸、郊狼或野猫的猎物。成鸟并没有天敌，但与鹰、雪鸮及其他美洲雕鸮对抗时可能会被杀死。